AMPHIBIAWEB

1 Mayo 2009

Protocolo Para Muestras de Quitridio: MÈtodo SWAB

in English

PDF

El protocolo que a continuaciÛn se describe es utilizado en campo, cautiverio y en laboratorio.

Este protocolo fue desarrollado para permitir a los biÛlogos de campo, tomar muestras no invasivas a anfibios de vida silvestre, con el fin de detectar en laboratorio al hongo quitridio Batrachochytrium dendrobatidis. Este protocolo esta basado en la publicaciÛn de Boyle et al. (2004).

Si tiene preguntas, favor de contactar a Vance Vredenburg (vancev@sfsu.edu).


Provisiones:

SWABS: (Cotonetes)

Hay dos formas como puede ordenarlos:

  1. Directamente: Medical Wire and Equipment: Se encuentra en http://mwe-usa.com/mwe/mwe.php El cÛdigo de producto es MW113.

  1. Usando distribuidor: Advantage Bundling SP. (n˙mero de catalogo, MW113). El distribuidor Advantage Bundling puede ser localizado por medio de telÈfono al: 1-866-Bundling, o tambiÈn puede usar e-mail: sales@advantagebundlingsp.com.

Nota: Preferiblemente utilice estos SWABS (cotonetes) ya que son necesarios para realizar el protocolo de laboratorio.

FRASCOS O TUBOS:

Tubos de 1.5 ml para microcentrÌfuga, los cuales deben de tener tapa de tuerca. Estos tubos son est·ndares y se pueden ordenar a travÈs de muchas compaÒÌas. Un ejemplo es Fisher Scientific (n˙mero de catalogo 05-669-12). Antes de usar los tubos deben de ser esterilizados en autoclave o pueden ser adquiridos ya pre-esterilizados, pero a un costo mayor (Fisher n˙mero de catalogo 05-669-17).

MARCAJE DE TUBOS:

Cuando sea posible, use marcadores a prueba de etanol, para etiquetar sus viales, de esta manera permanecer·n identificados por m·s tiempo. Algunas personas prefieren rayar la identificaciÛn en el vial, ya que no puede ser lavada o borrada por accidente.


Procedimiento

1. Preferiblemente, capture los anfibios a mano. Es muy importante que use guantes, si le es muy difÌcil conseguirlos, usted tambiÈn puede usar bolsas de pl·stico. Debe de cambiarse los guantes entre toma y toma de muestra. Si usted utiliza una red para la captura de anfibios, estÈ consiente de que las zoosporas de B. dendrobatidis podrÌan adherirse a la red y Èstas posiblemente se transferirÌan a los individuos, por lo tanto utilice siempre que le sea posible diversas redes, o desinfecte la red tanto como usted pueda, de preferencia entre cada captura (por favor que sean tan a menudo como usted pueda, ya que no es la soluciÛn perfecta a este problema).

2. En adultos y metamÛrficos el SWAB (cotonete) debe de ser deslizado en total 30 veces en las siguientes partes del anfibio: la superficie inferior o vientre, ingles, piernas, membranas intedigitales (membranas entre cada uno de dedos de los miembros inferiores). Recuerde que de hecho usted est· raspando cantidades muy pequeÒas de tejido muy fino de la piel del anfibio, pero debe de ser cuidadoso de no lastimar al animal. Se debe de aplicar una cierta presiÛn sobre el animal, pero esto no significa que usted deba de aplastar al anfibio. Las ·reas donde nos debemos de enfocar al realizar el raspado, son aquellas que tengan mayor cantidad de queratina, como lo son: la ingle, muslos y membranas interdigitales. Para los renacuajos, se desliza el SWAB (cotonete) en la ˙nica ·rea queratinizada del anfibio en este estadio de desarrollo: la boca.

  1. Seque el SWAB (cotonete) al aire por aproximadamente 5 minutos, si es posible evite el contacto directo de la luz del sol sobre el SWAB (si las condiciones son demasiado h˙medas, entonces puede colocar el SWAB en etanol EtOH al 95%).

  1. Rompa el palillo de soporte del SWAB (cotonete) aproximadamente a unos 3cm de la punta y colÛquelo una vez seco en el tubo vacÌo (o en su defecto con etanol al 95 %). Debe de tener cuidado de que el palillo del SWAB (cotonete) no toque la tapa del tubo o vial. Atornille la tapa en el vial y almacene en un lugar sombreado.
  1. Las muestras pueden ser guardadas a una temperatura ambiente por una semana o quiz· m·s tiempo, pero es mejor mantener las muestras frescas y colocarlas tan pronto como sea posible en un congelador a 4∞ C (el tipo de congelador que usted tiene en casa, estar· bien). Evite temperaturas extremas y la luz del sol directa. Las muestras podr·n ser almacenadas en un congelador por muchos meses, sin problemas.

  1. El an·lisis de los SWABS (cotonetes): Nosotros utilizamos la metodologÌa de PCR cuantitativo, descrita por Boyle et al. (2004).

Seleccione para Observar el video con las instrucciones:

Video de la tÈcnica para la toma de muestras de quitridiomicosis por SWABS (cotonetes)

Ver nuestros otros vídeos


Etiquetado:

Los tubos deben de ser etiquetados por el primer colector, la ˙ltima inicial debe ser seguida de una ìSî de SWAB, y seguida por un n˙mero de tres dÌgitos, empezando por el 001. Por ejemplo, el colector Carlos Barajas, en su primer SWAB, el etiquetado deberÌa ser: CBS001Ö Nosotros no asignamos ning˙n otro n˙mero de identificaciÛn al vial, por lo que no se debe de rehusar los n˙meros.
Otros datos. Junto con el n˙mero de colecta tambiÈn pueden ser colocados en el vial o en una libreta de campo: IdentificaciÛn del sitio, Nombre del Sitio, Observaciones, Hora, Especie, H·bitat (pantano, rÌo, charco), Estadio de Vida (larva, sub-adulto, adulto) Estadio seg˙n Gosner, Peso, Longitud Hocico-Cloaca (SVL), Sexo, Notas de la condiciÛn del animal (let·rgico, irritable, respuesta de reflejos, etc.).



An·lisis de SWABS (cotonetes):
Desafortunadamente, nuestro laboratorio no tiene los recursos para analizar los SWABS (cotonetes) para otros grupos de investigaciÛn. Las muestras tienen tÌpicamente un costo aproximado de $4-10 dÛlares por cada una, Èste precio no incluye el costo de trabajo. Hasta que las m·quinas de PCR cuantitativo lleguen a ser m·s comunes, creemos que bajar·n los costos y que la tÈcnica descrita por Boyle et al. (2004) se aplicar· m·s extensamente para medir, cuantificar y estudiar la extensiÛn de la quitridiomicosis en el campo.


BibliografÌa:

Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., and Hyatt, A. D. (2004). Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms 60: 141-148.


Contactos:

Vance T. Vredenburg
Assistant Professor
Department of Biology
227 Hensill Hall
San Francisco State University
1600 Holloway Avenue
San Francisco, CA 94132
tel. (415) 338-7296
Email Vance

Cherie Briggs
Professor
Department of Ecology, Evolution, and Marine Biology
2112 Noble Hall
University of California, Santa Barbara
Santa Barbara, CA 93106-9610
Email Cherie