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Protocole de prélèvement de chytrides

Publié en anglais le 1 mai 2009
Traduit en français le 30 octobre 2015 (par Axel C. Hauduc, édité par Alessandro Catenazzi)

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  • Ce protocole a été créé pour permettre aux biologistes de prélever des échantillons de Batrachochytrium dendrobatidis d’une manière non-destructive. Ce document est préparé par le groupe de recherche Briggs NIH depuis Boyle et al. (2004). Contactez Vance Vredenburg (vancev AT sfsu.edu) ou Cherie Briggs (briggs AT lifesci.ucsb.edu) si vous avez des questions.


    Matériaux:

    • Écouvillons (coton-tiges): ils peuvent être commandés de deux façons (liens fournis pour convenance: AmphibiaWeb ne cautionne ni ne profite pas de ces produits ; il s’agit de produits que nos laboratoires utilisent):

    1. En commandant directement chez le producteur Medical Wire and Equipment (http://www.mwe.co.uk/) : le code produit est MW113.
    2. Aux États-Unis, en utilisant le distributeur : Advantage Bundling SP (numéro de catalogue MW113). Le distributeur Advantage Bundling est atteignable aux EEUU par téléphone au numéro 1-866-Bundling. Les commandes peuvent aussi être placées par email à sales@advantagebundlingsp.com

    • Tubes pour stockage des écouvilles : tubes de centrifugation de 1.5 ml avec bouchon à vis. Peuvent être achetés chez plusieurs vendeurs, comme Fisher (numéro de catalogue 05-669-12). Chaque tube de centrifugation doit être stérilisé avant usage, soit à l’autoclave, soit qu’il aie été acheté pré-stérilisé à un prix élevé.

    • Étiquetage : Quand c’est possible, utilisez un feutre indelebile noir résistant à l’éthanol pour étiqueter vos tubes car leur écriture dure plus longtemps. Il est aussi possible de graver l’identification d’un échantillon directement sur le tube pour éviter qu’elle soit effacée par accident.


    Procédure :

    1. Préférablement, capturez les amphibiens à la main. Mettez des gants jetables durant le frottement de la peau des amphibiens, et changez les gants après chaque individu. Si vous utilisez une épuisette, changez ou désinfectez-la entre chaque capture d’animal pour prévenir le transfert de B. dendrobatidis.

    2. Frottez la peau sur le coté ventral de l’adulte 30 fois. Souvenez-vous que vous êtes en train de prélever des petites quantités de tissu épidermique. Il est recommendé d’exercer une certaine pression sur la peau, mais en évitant de blesser l’animal. Privilegiez les zones absorbantes du ventre, des cuisses, et des membranes entre les doigts des pieds.

    3. Séchez le coton-tige à l’air pendant à peu près 5 minutes, en le protégeant du soleil si possible. Si les conditions sont trop humides, conservez-le dans de l’éthanol (95% EtOH).

    4. Coupez le coton-tige à ~3 cm du bout absorbant et mettez le bout absorbant dans un tube vide. Le coton-tige ne devrait pas toucher le haut du tube. Fermez le bouchon du tube, et gardez le tube dans un endroit protégé du soleil.

    5. Les échantillons peuvent être stockés à température ambiante pendant à peu près une semaine, mais il vaut mieux de les garder au frais aussi tôt que possible dans un congélateur conventionnel

    6. Pour l’analyse des coton-tiges, on utilise la méthode de PCR quantitative décrite par Boyle et al. (2004).

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    Étiquetage:

    Les tubes doivent être étiquetés avec les initiales du collecteur, suivies d’une lettre pour le coton-tige et d’un numéro à trois chiffres commençant par 001. Par exemple : le premier échantillon de Cherie Briggs sera marqué « CBS001 ». Ne réutilisez pas les numéros d’identification car chaque tube n’en reçoit qu’un.

    Collection d’autres données:

    Des données additionnelles devraient aussi être placées avec le numéro d’identification de l’échantillon, par example l’identification du site, les coordonnées GPS, le nom du site, l’observateur, l’heure, l’espèce, le type d’habitat (par ex., marais, rivière, etc.), stade de développement (par ex., têtard, juvenil, adulte, etc.), stade de Gosner, poids, sexe, numéro PIT, et notes sur la condition de l’animal (par ex., léthargique, blessé, etc.).


    Analyse des échantillons:

    Malheureusement, ni le laboratoire Briggs, ni le laboratoire Vredenburg, n’ont les ressources nécessaires pour analyser les échantillons d’autres groups de recherche. L’analyse de chaque échantillon coûte entre $4 et $10, frais de main-d’œuvre exclus. Quand les machines de PCR quantitative deviendront moins chères, nous anticipons que les coûts d’analyse diminueront, et que la technique décrite par Boyle et al. (2004) sera de plus en plus appliquée pour mesurer et observer la propagation de la chytridiomycose.


    Références :

    Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., and Hyatt, A. D. (2004). Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms 60: 141-148.


    Contacts:

    Vance T. Vredenburg
    Assistant Professor
    Department of Biology
    227 Hensill Hall
    San Francisco State University
    1600 Holloway Avenue
    San Francisco, CA 94132
    tel. (415) 338-7296
    Émaillez Vance

    Cherie Briggs
    Professor
    Department of Ecology, Evolution, and Marine Biology
    2112 Noble Hall
    University of California, Santa Barbara
    Santa Barbara, CA 93106-9610
    Émaillez Cherie